背景

寡核酸藥物是一類創新性的治療方法，其作用機制獨特而強大。這些藥物通過干預基因轉錄和翻譯過程，能夠從根本上調控致病基因的表達，從而達到治療效果。寡核酸藥物是目前發展最為迅速的基因療法之一，一般是由12~30個核苷酸單鏈或雙鏈組成的一類藥物,通過直接靶向致病靶基因或作用于信使RNA(mRNA)來調控致病基因轉錄翻譯，具有高特異性，通常采用固相亞磷酰胺化學法來進行合成。

在寡核酸藥物的合成過程中，包括磷酸骨架、糖環、堿基在內的眾多點位均有可能產生不同類型的副反應，同時受到合成效率以及原料質量等的影響，導致粗品中含有多種不同的雜質，最難控制的一類雜質是由于單個或多個核酸單體差異導致的失敗序列（N-x/N+y）。這些N-x與N+y雜質的性質與目標產物非常接近，在分子大小、電荷和疏水性方面的差異通常很。笮拇炕ひ沾淳藪蟮奶粽劍銑珊蟊匭氬捎酶叻直媛蝕炕際酰拍蓯鼓勘攴腫佑朐又史擲。

寡核苷酸藥物的純化工藝挑戰

層析步驟是控制產品相關雜質的關鍵工藝步驟，而層析工藝開發的核心在于掌握并利用不同類型雜質與藥物活性成分 (API) 的性質差異，常見的可能影響樣品層析行為的性質差異主要包括以下幾類：

帶電基團：寡核酸所帶靜電荷取決于磷酸或修飾基團的數目，堿基的數目以及二級結構是否遮蔽帶電基團；通常在變性條件（例pH12）打開氫鍵使結構展開并且堿基不帶電（pH>pKa），以有效區分N-1雜質。

DMT on/off：DMT是一個強疏水性基團，與反相層析/疏水層析產生相互作用。因此可以用于帶有DMT的全長序列的分離。

硫醇化 (Thiolation)：當磷酸基團中的氧原子被硫原子取代時，帶負電的基團極性增加，在大多數 pH 條件下與陰離子交換填料結合更強。

甲基化（Methylation）：當氧原子被甲基取代時，疏水性增強。

脫嘌呤 (Depurination)：過度的酸性暴露會導致嘌呤堿基與脫氧核糖之間的斷裂，在一定 pH 條件下會改變分子電荷與疏水性。

因此，寡核酸藥物的層析純化，實際上主要依賴的是API 與 PRI 分子之間電荷與非極性基團的數量差異。根據合成結束后是否保留 DMT 基團以及是否選擇柱上脫保護，通常采用離子交換層析層析或反相制備色譜進行純化。

一離子交換層析：

陰離子交換層析（AIEX）是一種可以在水性條件下對寡核苷酸進行分離的實驗方法，無需使用高成本含有機溶劑洗脫液，也無需對車間和設備進行防爆設計，特別適合用于純化寡核苷酸。其中應用最廣泛的填料是15Q/30Q（銀河集團全資子公司漢德科技的HB-POR15Q），基架材質為聚苯乙烯，粒徑15/30 μm，操作空間大，載量高，變性條件（pH 12）下依然可對寡核苷酸樣品進行純化操作，避免了單鏈自互補或者富含GC堿基的寡核苷酸聚集。

和蛋白類樣品純化相似，寡合苷酸的純化工藝需要考慮多種因素的影響，例如純化緩沖液pH和鹽離子濃度、載量、流速、操作壓力、柱床高度、以及操作溫度等。需要根據樣品是否脫去最后一個DMT基團以及寡核苷酸長度來調整洗脫鹽離子濃度和洗脫體積。

Bio-lab 實驗室級層析系統

1.1 純化緩沖液pH和鹽離子濃度

純化緩沖液pH和鹽離子濃度是目標分子洗脫的重要因素之一，高pH洗脫劑的一個重要用途是控制單鏈自互補或者高GC條件下形成氫鍵聚集。大多數相互作用在pH 12時可以被打開，但是RNA在強堿性條件下不穩定，需在近中性或弱堿性環境下進行純化。

如果考慮到后期的工業放大，必須摸索最佳的高鹽洗脫比例，建議低于2M，并且洗脫的時間不能高于0.5h，氯離子濃度過高，會對不銹鋼材質具有一定腐蝕性。

1.2 樣品載量、保留時間和裝柱高度

寡核苷酸分子量低，電荷和疏水基團相對較少，可以適當調整保留時間和載量，達到更好的分離效果，對于比較有挑戰性的項目，可適當降低上樣量以保證分離純度，這主要是由于隨著上樣量的降低，雜質峰和主峰的峰面積在減小的同時兩者的交疊區也在減。誚兇櫸質占庇欣諤岣叩ス艽慷。

柱高的增加也有助于提高分辨率，考慮到細粒徑填料可能帶來的壓力問題，同時柱高的增加也會影響工業放大過程中填料的用量增多，導致成本增加，通常情況下裝填高度范圍在15-20cm左右。

1.3 純化溫度

純化溫度是具有挑戰性的參數之一，不同樣品熱穩定性存在差異。一般室溫條件下即可達到很好的純化效果，但有時也需要對純化溫度進行優化。此外，保證整個純化環境溫度的一致也很重要。

二反相制備液相色譜：

反相制備液相色譜(Preparative Reverse Phase Liquid Chromatography, Prep-RPLC)是一種基于溶質在極性流動相和非極性固定相之間的分配差異，通過精確檢測并收集相應的餾分來實現物質分離純化的技術。在這項技術中，固定相通常采用非極性鍵合相填料，如C18、C8烷基鏈鍵合的硅膠，而流動相則由極性有機溶劑（如甲醇、乙腈）和水按一定比例組成。

RP-HPLC 利用固相中的疏水性可以很好的結合含有5’-DMT的寡核苷酸，沒有DMT保護的核苷酸雜質由于結合力比較弱，可以被先洗脫下來，含5’-DMT的寡核苷酸用較強的溶劑洗脫下來，最后去除5’-DMT，做到很好的分離。

實驗室級制備液相色譜系統

2.1 色譜柱選擇

需選用高耐壓、高穩定性的反相色譜柱（裝填C18填料），以應對大規模生產中的壓力波動和長期使用需求，主要考慮填料的上樣量，分離度和回收率等之間平衡。

2.2 流動相的優化

通常采用乙腈-水體系，并添加少量酸（如0.1%甲酸）以抑制硅膠表面硅羥基的干擾，提升峰形對稱性。

在流動相中加入離子對試劑（如三乙胺乙酸鹽，六氟異丙醇），并控制流動相pH（如7.0-8.0）以穩定離子對復合物，其疏水端與寡核苷酸磷酸骨架結合，親水端溶于水相，使原本親水的寡核苷酸轉化為疏水復合物，從而增強其在反相色譜柱上的保留能力。

2.3 工藝放大挑戰

實驗室級別工藝開發后，需通過線性放大至工業化規模，要平衡上樣量、收率、純度和成本等因素。

寡核苷酸藥物的純化案例

一樣品1：

1.1 純化方法

合樣檢測純度93.031%，樣品收率：81.3%。

二樣品2：

2.1 純化方法

合樣檢測純度 95.48%，純化后樣品收率：75.74%。

三樣品3：英克司蘭AS鏈反相純化

采用漢德科技HB-C18HAQ-100-30填料裝填的制備柱，AS上樣量2.08mg/ml，自檢純度99.98%，收率95.01%；

四樣品4：英克司蘭SS鏈反相純化

采用漢德科技HB-C18HAQ-100-30填料裝填的制備柱，SS上樣量2mg/ml，自檢純度99.93%，收率90.9%；

寡核苷酸藥物整體解決方案

銀河集團/漢凰科技為客戶提供涵蓋核酸合成系統、離子交換層析系統、反相制備液相色譜系統及切向流過濾系統在內的完整產品組合，全面支持從基礎研究、工藝開發到規模化生產的各個環節。公司產品線可滿足從實驗室級別探索、中試工藝放大到工業級生產的全方位需求，憑借穩定可靠的系統性能和靈活可擴展的配置方案，為小核酸藥物從早期研發到商業化生產全流程提供堅實的技術支撐與解決方案。